Apenas os exames microbiológicos permitem estabelecer a etiologia desta infeção e a confirmação de existência de caso de doença “confirmado” ou de caso “provável”. Chama-se a atenção para o facto de eles não serem efetuados como rotina laboratorial no diagnóstico de pneumonia, devendo ser especificamente requisitados pelo clínico.

Exame cultural

O isolamento do agente em cultura permite isolar teoricamente qualquer estirpe pertencente a este género e continua a ser o método de referência (gold standard) e o único que permite, a posteriori, estudos epidemiológicos completos que incluem a tipificação das estirpes de origem humana e de origem ambiental e a consequente possibilidade de comparação entre as hipoteticamente associadas para estabelecimento de eventual relação causa/efeito.

O meio de cultura a utilizar deverá ser o BCYE-α e, em paralelo, o mesmo meio suplementado com antibióticos, BMPA ou GVPC. Um resultado negativo só será dado após dez dias de incubação, atendendo ao carácter fastidioso deste microrganismo.

É uma técnica que permite um diagnóstico de “caso confirmado” (critérios do ECDC e da OMS).

Pesquisa de antigénio em amostras respiratórias por Imunofluorescência Direta (IFD)

Esta técnica pode ser aplicada em diferentes amostras respiratórias como expetoração, secreções brônquicas, lavado bronco-alveolar e biópsia pulmonar. Tem as vantagens de poder ser utilizada vários dias após o início de antibioterapia e do seu resultado poder ser dado no próprio dia da colheita.

Com os reagentes atualmente disponíveis, utilizando anticorpos monoclonais, podemos fazer o diagnóstico de infeções por Legionella pneumophila e por algumas das espécies mais frequentemente associadas a doença no homem. Estão descritas reações cruzadas com outras bactérias pelo que continua a ser uma forma de diagnóstico de “caso provável” (ECDC e OMS).

Pesquisa de antigénio na urina - antigenúria (Imunocromatografia, ELISA e IFA)

Este método de diagnóstico é de execução rápida (resposta dada no próprio dia), tendo-se demonstrado que o antigénio começa a ser excretado nos três primeiros dias após o início dos sintomas, podendo excecionalmente persistir mais de 100 dias, o que poderá trazer dificuldades de interpretação em doentes com pneumonia recorrente (por exemplo, DPOC).

Podemos mesmo afirmar que se trata da técnica mais utilizada em todo o mundo e que tem levado à identificação de surtos epidémicos, permitindo nesses casos, uma resposta rápida das autoridades de saúde.

Com os reagentes comercializados e validados até agora, com esta técnica apenas podemos diagnosticar infeções por Legionella pneumophila sg1 (até ao momento, conhecem-se 16 serogrupos). Por esta razão, é preciso ter em atenção que um resultado negativo de antigenúria, atualmente, não exclui o diagnóstico de Doença dos Legionários.

Com a aplicação desta técnica, obtemos um diagnóstico de “caso confirmado”, apenas para L. pneumophila sg1 (ECDC, OMS).

Pesquisa de anticorpos no soro por Imunofluorescência Indireta (IFI)

A técnica mais aconselhada é a Imunofluorescência Indireta (IFI). Apesar da utilidade da aplicação do diagnóstico serológico, em particular em estudos de avaliação de prevalência da doença, estes testes continuam a ter algumas limitações. Não esquecendo a necessidade de obter sempre duas amostras de sangue do doente, colhidas com pelo menos 10 dias de intervalo, a cinética dos anticorpos tem mostrado grandes variações, mesmo em casos de diagnóstico feito com isolamento do agente.

A especificidade não é muito elevada pois continuam a identificar-se resultados falsamente positivos, devido a reações cruzadas com outras bactérias (muitas delas causadoras também de pneumonia).

A seroconversão (aumento de quatro vezes o primeiro título), com um 2º título igual ou superior a 128, para Lp sg1 é considerada como diagnóstico de “caso confirmado” (ECDC, OMS). Uma seroconversão para outra espécie ou serogrupo bem como um título único superior ou igual a 256 é neste momento considerado como diagnóstico de “caso provável” (ECDC, OMS).

Pesquisa de ácido nucleico

Várias técnicas estão atualmente disponíveis, com diferentes graus de sensibilidade e especificidade mas ainda não padronizadas de modo a poderem ser utilizadas com fiabilidade em amostras biológicas (o mesmo não se passa para as amostras de água).

Qualquer resultado positivo deverá então, por enquanto, ser interpretado como diagnóstico de “caso provável” (ECDC, OMS).

Tipificação das estirpes

A tipificação de estirpes tem como objetivo principal a comparação de bactérias isoladas nos doentes com as isoladas em amostras de água ambiente, no decurso de investigações epidemiológicas.

O método fenotípico que pode ser usado como “screening” para Legionella pneumophila tem como base a utilização de um painel de anticorpos monoclonais (MAbs), através de técnica de IFI. Estão atualmente disponíveis dois painéis, o de Joly (MAb3) e o painel de Dresden, proposto por Helbig e colaboradores (LPS MAb), sendo este mais utilizado na Europa.

Quanto aos métodos de genotipagem, que complementam a técnica fenotípica acima referida, quer a PFGE, como a AP-PCR e a AFLP têm demonstrado diferente capacidade discriminativa.

Atualmente, a técnica desenvolvida pelo EWGLI nos últimos anos, “Sequence-Based Typing” (SBT) e cuja implementação tem vindo a ser avaliada na investigação de surtos epidémicos, apresenta bons resultados, em particular a última versão da base de dados (versão 5.0) que utiliza sete alelos (fla A, pilE, asd, mip, mompS, proA e neuA) para o estabelecimento do perfil “ST” ou “perfil alélico”.